Mười năm trước, chuyến bay SA-407 đã trở thành nỗi ám ảnh kinh hoàng khi xảy ra hàng loạt hiện tượng siêu nhiên bí ẩn, khiến toàn bộ hành khách thiệt mạng. Người duy nhất sống sót là nữ tiếp viên New – người đã nhắm mắt và mặc kệ tất cả cho đến khi máy bay hạ cánh.
Ở hiện tại, chiếc máy bay SA-407 được sơn sửa và đưa vào hoạt động trở lại với một nhóm hành khách mới: gia đình Gift, Phen và Jamras; nữ du khách Ann cùng người thầm thương Wave; cặp đôi John và Michelle; tiếp viên Prince; kỹ sư bảo trì Bank; một nhà sư, một bà lão, một gã đàn ông Mỹ biến thái; cùng hai tiếp viên khác và cơ trưởng.
Trong chuyến bay, oxy trong khoang bất ngờ giảm mạnh. Bank buộc phải xuống hầm hàng để sửa chữa. Trong quá trình này, bà lão tử vong, còn Bank phát hiện có sự cố chập điện ở hệ thống nén oxy. Anh kịp thời cứu New khi cô suýt ngạt thở. Nhưng cũng từ đây, hàng loạt hiện tượng rùng rợn bắt đầu: thi thể biến mất, hành khách bị ám và quay sang sát hại lẫn nhau.
Cuối cùng, chỉ còn lại Gift, Jamras, Phen, Bank và New. Phen bị vong nhập, điên cuồng bóp cổ New, nhưng một chiếc xe đẩy bất ngờ trượt tới, đâm chết Phen bằng những chiếc nĩa. Bank và Jamras nắm quyền điều khiển, hạ cánh máy bay an toàn.
Trong suốt chuyến đi, Phen nhiều lần buộc tội New chính là nguồn gốc của mọi hiện tượng ma quái trên máy bay. Tuy nhiên, Gift và Jamras luôn gạt đi. Khi xe cứu thương đến, Gift hoảng hốt hỏi New đâu rồi, còn Bank nhìn thấy linh hồn cô vẫn ngồi trên ghế trong khoang. Sự thật hé lộ: New đã chết cùng Phen. Tất cả chỉ là sự trả thù từ những linh hồn năm xưa – vì mười năm trước New chỉ nghĩ đến việc sống sót cho riêng mình, bỏ mặc toàn bộ hành khách khác.
Bộ phim Chuyến Bay Định Mệnh 407 khép lại bằng cảnh chiếc máy bay tiếp tục được sơn sửa để hoạt động, còn linh hồn New vẫn ngồi im lặng trong bóng tối, mãi mãi mắc kẹt cùng lời nguyền định mệnh.
